Materiales: Reactivos: Muestras:
*vaso de bohemia *ácido etanóico 2,0 M *leche descremada
*varilla de
vidrio *hidróxido de sodio al 10% *suero de leche
*mechero * sulfato cúprico al 1% *ovoalbúmina
*soporte *ácido nítrico concentrado *gelatina
*tela
metalica *aspartamo
*gradilla *glicina
*tubos de ensayo
*termómetro
*papel de filtro
FUNDAMENTOS DE LA EXPERIENCIA:
Las proteínas juegan un papel fundamental en
la vida. La hidrólisis de éstas forma aminoácidos, los cuales son esenciales
para un buen desarrollo y funcionamiento orgánico.
En un principio se someten las muestras
bajo los ensayos de Biuret y Xantoprotéico. Al hacer esto nos aseguramos de
determinar la existencia de enlaces peptídicos en las estructuras moleculares
pertenecientes a las muestras sometidas bajo ensayo.
Tal es la importancia de las proteínas, que
determinar su cantidad en una muestra puede ayudar a diagnosticar ciertas
enfermedades, como sobrecarga del hígado, miopía y cataratas. La presencia de proteínas
en la orina de un paciente es un claro indicador de falla renal.
ACCIÓN DE BIURET:
La reacción de Biuret es producida por péptidos y
proteínas de cadena corta. Da positiva esta reacción en todos los compuestos
que tengan dos o más enlaces Peptídicos consecutivos en sus moléculas.
Al colocar caseína en un tubo de ensayo junto con 20
gotas de NaOH (hidróxido de sodio) al 10%, más 4 gotas de solución de CuSO4 (sulfato
cúprico) al 1%,
observamos que la muestra toma un color violáceo intenso, muy similar a la
amatista. Esto sucede debido a la formación de la biurea. Esta sustancia se
genera a partir de la pérdida de una molécula de amoníaco entre dos moléculas
de urea. Esto sucede debido a la acción entre cationes Cu2+ y los pares de
electrones no compartidos pertenecientes al N. Los ensayos de Biuret se caracterizan por ser
muy sensibles debido a que es posible de que reaccionen con otras sustancias,
dando lugar a un falso positivo. Para evitar un falso positivo se considera que
se debería tener un indicio de la composición de la muestra. Un Biuret falso se
caracteriza por tener un color celeste pálido. Al ser un ensayo sensible, cabe
la posibilidad de la existencia de falsos negativos. Esto puede implicar que la
cantidad de proteínas en la muestra sea de una baja concentración. Un negativo
concluyente implica la falta de enlaces peptídicos en la muestra analizada. |
ACCIÓN DE XANTOPROTÉICO:
La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de radicales fenilos, especialmente en presencia de tirosina.
La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico formando el hidroxi-benceno, que da el color amarillo a ph acido, característico de esta reacción.
radical fenilo reaccionando con el HNO3
La reacción xantoproteica es un método que se puede utilizar para determinar la presencia de proteínas solubles en una solución, empleando ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de radicales fenilos, especialmente en presencia de tirosina.
La reacción xantoproteica se puede considerar como una sustitución electrofílica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico formando el hidroxi-benceno, que da el color amarillo a ph acido, característico de esta reacción.
INFORMACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS MUESTRAS SOMETIDAS A ENSAYO:
MUESTRAS SOMETIDAS A ENSAYO:
-caseína
-aspartamo
-ovoalbúmina -glicina
-gelatina
-suero de leche
CASEINA: Al someter la caseína a ensayos de Biuret y Xantoprotéico,
ambos ensayos dieron un resultado positivo. La caseína es una sustancia que se
compone de más de 200 aminoácidos.
La
caseína es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de
aminoácidos ácidos, con un PI=4,6. Ésta reacciona con bases formando
caseinatos, útiles en tanto la industria textil como para la fabricación de
colas y adhesivos.
La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de la formación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico.
La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de la formación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico.
Para obtener la caseína, es preciso colocar
aproximadamente 25mL de leche descremada en un vaso de Bohemia. Procedemos calentando
la leche hasta alcanzar una temperatura aproximada de 40ºC, para luego ir
adicionando, gota a gota, ácido etanóico 2,0 M. Al agregar el ácido buscamos la
formación de coágulos de caseína. Se separan los coágulos del suero secándolos
con mucho cuidado. A continuación se filtra el suero y se reserva para futuro
análisis. Colocamos una muestra de caseína en dos tubos, de un tamaño
aproximado de 1 cm3 y se
realizan los ensayos ya mencionados. Al realizar el ensayo de Biuret obtenemos
un resultado positivo, concluyendo la existencia de varios enlaces peptídicos
en la muestra seleccionada. Cuando sometemos la muestra al ensayo Xantoprotéico,
obtenemos también un positivo. De esta manera concluimos la presencia de tirosina o triptófano en la caseína
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| Suero de meche y coágulos de caseína suspendidos |
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| Caseína |
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| Ensayo de Biuret positivos, presencia de enlaces peptídicos. |
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| xantoproteico positivo, presencia de tirosina o triptófano |
OVOALBÚMINA: la ovoalbúmina es la principal proteína existente en la clara de huevo. Se trata de una proteína que se desnaturaliza fácilmente con el calor. Es la proteína de mayor valor biológico ya que tiene en su composición, en grandes cantidades, los ocho aminoácidos esenciales. Dicha proteína tiene usos en la industria del vino, como agente de encolado. Es también utilizado como suplemento alimenticio, estabilizador y espumante en repostería y panadería, pero también utilizado como tratamiento para la intoxicación con metales pesados. La ovoalbúmina tiene propiedades características, como ser, la insolubilidad en agua, solubilidad en soluciones básicas, resistencia a tratamientos térmicos suaves (bajo los 80º C, ya que coagula) y también por ser rica en cisteína y metionina. Para dedicarnos a trabajar con esta sustancia, separamos la clara de la yema de un huevo. Continuamos agregandole agua a la clara y vertiendo aproximadamente 1cm3 de la solucion en dos tubos de ensayo. Al realizar el ensayo de Biuret, obtenemos un resultado positivo. para realizar el ensayo Xantoprotéico, es necesario poner la solución a baño María. Al realizar este ensayo obtenemos también un positivo.
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| biuret positivo. |
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| xantoprotéico positivo |
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| fibras de colágeno |
Para el análisis de la gelatina, necesitamos hidratarla. Para esto se la coloca en un Vaso de bohemia junto con agua, batiendo para evitar la formación de grumos. Luego se la coloca sobre el mechero hasta que la solución rompa hervor. Colocamos la muestra en dos tubos de ensayo y se deja correr agua fria por la superficie externa del tubo de ensayo con el fin de enfriar. realizamos los ensayos correspondientes y concluimos la existencia de enlaces peptídios, significando Biuret positivo. También concluímos la ausencia de triptófano y tirosina, significando Xantoprotéico negativo.
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| biuret positivo |
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| Xantoprotéico negativo |
El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C.La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa.
Biuret negativo
GLICINA:
La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial.
Biuret negativo
LOS RESULTADOS OBTENIDOS FUERON LOS SEGUIENTES:
MUESTRA BIURET XANTOPROTEICO
Caseína + +
Gelatina + -
Ovoalbúmina + +
Aspartamo - -
Glicina - -
SEGUNDA PARTE DE LA EXPERIENCIA: DIALISIS.-
FUNDAMENTO DEL PROCEDIMIENTO:
La diálisis es el proceso para separar las moléculas en una solución por la diferencia en sus índices de difusión, siendo la difusión el movimiento de las moléculas de una región de alta concentración a otra de menor concentración producida por la energía cinética de las partículas, a través de una membrana semipermeable.
Para realizar la diálisis se coloca agua destilada en un vaso de Bohemia sumergiendo el dializador. Mientras que dentro del dializador se colocará una solución compuesta de ovolbúmina con NaCl .
Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar por los poros de la membrana semipermeable tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del dializador en la dirección del medio con concentración más baja.
Por otro lado las moléculas más grandes, que presentan dimensiones significativamente mayores que el diámetro de los poros de la membrana, son retenidos en el interior del dializador.
En el cuerpo humano se ven repetidos los principios de diálisis ya explicados. Los riñones poseen un tejido que se caracteriza por filtrar sustancias nocivas para el cuerpo humano. Los riñones filtran dichas sustancias para luego expulsarlas en la orina.
Para esta práctica utilizaremos los siguientes materiales:
* Tubos de ensayos
* Clara de huevo (ovoalbúmina )
* NaCl ( cloruro de sodio )
* Vaso de bohemia
* Dializador
* Agua destilada
* AgNO3 (Nitrato de plata)
* CuSO4 al 1% (sulfato cúprico )
* NaOH al 10% (hidróxido de sodio )
El dializador consiste en una botella de plástico cortada en su base cubierta por papel celofán y atada con una gomita elástica.
El papel celofán es el que cumple el rol de membrana semipermeable en nuestro dializador casero.
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| dializador. EJECUCIÓN DE LA ACTIVIDAD: PRIMERA PARTE: |
* Primero debemos colocar en dos tubos de ensayos diferentes aproximadamente 1cm3 de la solución acuosa de ovoalbúmina(proteína) y cloruro de sodio.* En uno de esos tubos de ensayo se aplicará la reacción biuret , es decir , se colocaran 20 gotas de NaOH al 10 % y 4 gotas de CuSO4
* En el otro tubo de ensayo se colocaran 3 gotas de nitrato de plata.
* Luego se anotaran las observaciones .
Para detectar el anión cloruro (cl- ) utilizamos el nitrato de plata (AgNO3)
Tanto el nitrato de plata como el cloruro de sodio se disocian en agua de la siguiente manera:
AgNO3 Ag+(ac) + NO3 – (ac)
NaCl Na+ (ac) + Cl – (ac)
De esta manera el catión plata y el anión cloruro se unen formando una sustancia insoluble:
Ag+ (ac) + Cl – (ac) AgCl (s)
Esta sustancia que se forma es cloruro de plata que precipita en forma solida y blanca.
Tomando en cuenta que precipitar hace referencia a un sólido que se forma a partir de la mezcla de sustancias en estado liquido.
La formación de este precipitado es quien determina que el ensayo sea positivo o negativo.
Observación:
Una vez realizados estos pasos podemos observar como en ambos casos la reacción da positiva y por ende la solución presenta sales y proteínas.
SEGUNDA PARTE:
* Primero se vierte agua destilada en el vaso de bohemia y luego se coloca dentro del mismo el dializador.
* Se coloca en el interior del dializador la solución acuosa de ovoalbúmina (proteína) y cloruro de sodio , previamente preparada.
* Se espera unos minutos de manera que el transporte pasivo de cationes sodio y aniones cloruro se iguale tanto en el interior como en el exterior del dializador.
* Una vez hecho esto se toma dos muestras de la solución presente en el interior del dializador y dos muestras de la solución presente en el exterior del dializador.
* A una de las muestras del interior y otra del exterior del dializador se le aplicara la reacción de biuret y se registraran los resultados.
* A la otra muestra del interior y del exterior del dializador se le aplicara nitrato de plata y se registraran los resultados.
Observaciones:
a) En el interior del dializador
* Biuret: POSITIVO
* Nitrato de plata: POSITIVO
Las observaciones nos permiten concluir que si bien el ensayo de nitrato de plata dio positivo la concentración de sales en la muestra disminuyo.
Por el otro lado , el ensayo de biuret dio positivo ya que las proteínas de la muestra no pudieron atravesar la membrana semipermeable del dializador.
b)En el exterior del dializador ( inicialmente: vaso de bohemia con agua destilada )
* Biuret: NEGATIVO
* AgNO3: POSITIVO
El resultado nos permite concluir que si bien el nitrato de plata dio positivo ( lo cual indica la presencia de sales en la solución que en un comienzo no habían ) , el ensayo de biuret dio negativo lo cual indica que no hay presencia de proteínas en la solución y que por lo tanto la proteínas no pudieron atravesar la membrana semipermeable del dializador.
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| INTERIOR DEL DIALIZADOR- ENSAYO DE AgNo3 positivo, biuret positivo |
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| EXTERIOR DEL DIALIZADOR: ensayo de AgNO3 positivo, biuret negativo |
ALUMNOS- CARRAU, PARDO, VASCONCELOS
